實時定量PCR（RT-qPCR）是一種在DNA擴增反應中，通過熒光化學物質測量每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法，常用于定量分析特定DNA序列。
RT-qPCR的實驗操作流程：
1、引物設計：引物設計需遵循一般原則，產物長度應控制在80-150bp，以保證擴增效率和特異性。
RNA提取：提取細胞總RNA，包括清洗、裂解、分離和沉淀RNA步驟。
2、RNA濃度測定：使用如Nano drop等儀器測定RNA濃度。
3、反轉錄合成cDNA：使用反轉錄酶將RNA轉換為cDNA，作為qPCR的模板。
4、qPCR反應體系配置：實驗通常使用2×濃縮的real-time qPCR MasterMix。需要加入模板和引物。每個樣品至少做3個平行孔，以確保數據的可統計性。
5、上機操作：將配置好的反應液放入實時qPCR儀中，設置相應的溫度循環和采集模式，進行擴增檢測。real-time qPCR不需要常規PCR的三步法（變性、退火、延伸）。 由于產物長度短（80-150 bp），通常只需要變性和退火步驟。 使用SYBR Green等染料時，PCR后應加溶解程序以形成溶解曲線，判斷特異性擴增。
6、數據分析：通過擴增曲線和融解曲線分析，可進行相對定量或絕對定量分析。相對定量用于比較靶基因在不同樣本中的表達差異，絕對定量用于測定樣本中靶基因的確切拷貝數。
7、常見問題分析：注意MasterMix不要反復凍融，常使用時可溶解后存放于4°C。 配制時應在冰上操作，每管或每孔換新槍頭，避免加樣誤差。 如無Ct值出現、Ct值出現過晚、標準曲線線性關系不佳、負對照有信號、溶解曲線異常、擴增效率低等問題，需針對具體情況進行調整和優化。
