ELISA（酶聯免疫吸附試驗）是一種基于抗原-抗體特異性反應的高靈敏度檢測技術，廣泛用于定量或定性檢測蛋白質、抗體、激素等生物分子。實驗結束后，原始OD值必須經過系統化處理才能轉化為有意義的生物學結論。正確的數據處理不僅能提高結果可靠性，還能避免假陽性或假陰性判斷。
數據預處理與標準化
在進行正式分析前，原始OD值需經過以下處理以確保準確性：
1、扣除背景：將所有孔（標準品與樣本）的OD值減去空白孔（Blank）的平均OD值，消除試劑本底干擾。
2、復孔處理：每個樣本和標準品建議設置復孔或三孔，取平均值用于后續分析，并計算變異系數（CV%），一般要求CV < 20%，以評估實驗重復性。
3、異常值剔除：若某復孔與其他差異顯著，應檢查加樣是否失誤，必要時可剔除后重新計算均值。
標準曲線繪制與擬合方法對比
標準曲線是定量ELISA的數據基石。不同擬合方法適用于不同類型的數據分布：
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擬合方法 |
適用場景 |
曲線形狀 |
優點 |
缺點 |
推薦使用 |
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線性回歸 |
數據呈直線趨勢 |
直線 |
簡單直觀 |
壓縮低濃度端，精度差 |
? 不推薦 |
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半對數圖 |
寬范圍濃度比較 |
S型 |
改善低端壓縮 |
高端易失線性 |
可選 |
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四參數邏輯模型 (4PL) |
多數免疫分析，尤其S型曲線 |
對稱S型 |
擬合度高，R2常 > 0.99 |
需專業軟件支持 |
? 強烈推薦 |
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五參數邏輯模型 (5PL) |
不對稱響應曲線 |
不對稱S型 |
更貼合真實反應動力學 |
計算復雜 |
? 如支持 |
特別說明：大多數現代ELISA數據分析軟件（如CurveExpert 1.4、專用酶標儀軟件）均支持4PL/5PL擬合，優先選擇R2 ≥ 0.99且無明顯拐點偏離的模型。
樣本濃度計算流程
代入方程：將經背景校正后的樣本OD值代入標準曲線擬合公式，得到初步濃度。
稀釋修正：若樣本經過稀釋，最終濃度 = 計算濃度 × 稀釋倍數。
有效性判斷：
若樣本OD值超出標準曲線范圍（過高或過低），結果不可靠，應重新稀釋后檢測。
對于定性ELISA，需設定截斷值（Cutoff），常見公式為：Cutoff = 陰性質控均值 × 系數（如2.1），樣本OD ≥ Cutoff 判為陽性
質量控制與誤差管理
確保數據可靠的關鍵環節：
1、設置對照：
陰性質控（Negative Control）：驗證非特異性結合水平。
陽性質控（Positive Control）：監控實驗系統是否正常工作。
2、避免假陽性/陰性：
溶血、脂血或細菌污染可能導致假陽性（如內源性HRP干擾）。
標準曲線最高點OD應介于0.8–3.0之間，否則可能超出儀器檢測范圍或反應不足。
3、操作規范：嚴格遵循試劑盒說明書，注意抗凝劑選擇（如EDTA可能干擾某些反應），避免反復凍融樣本。
ELISA數據處理的關鍵在于標準化操作和科學擬合方法的選擇。定量分析應優先采用4PL/5PL模型進行標準曲線擬合，并嚴格進行數據校正與質量控制，以確保結果準確可靠。忽視這些步驟可能導致濃度估算偏差或假陽性/陰性結果。
