熒光定量PCR（qPCR）廣泛應用于基因表達分析、病原體檢測、SNP分型等領域。其優勢在于可實時監控擴增過程，實現高靈敏度和寬動態范圍的定量。然而，任何環節的疏漏都會導致結果偏差，因此必須遵循標準化流程并進行充分優化。
高效實驗設計全流程
1、明確實驗目標
不同應用對實驗設計要求不同：
基因表達分析需關注RNA質量、逆轉錄效率與內參基因選擇；
病毒拷貝數測定依賴標準曲線與已知濃度模板；
SNP分型則強調引物/探針的等位基因特異性。
2、靶序列與引物探針設計
引物長度建議18–24 bp，Tm值55–65°C，GC含量40%–60%；
擴增片段長度推薦60–200 bp，以提高擴增效率并降低二級結構影響；
探針設計（如TaqMan）時，Tm值應比引物高5–10°C，長度25–35 bp；
使用BLAST核實序列特異性，避免非特異結合
3、防止gDNA污染策略
若檢測mRNA，應設計跨外顯子的引物，使基因組DNA無法有效擴增。同時設置“-RT”對照（無逆轉錄酶）驗證是否存在gDNA殘留。
4、反應體系優化關鍵參數
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參數 |
推薦范圍 |
影響說明 |
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Mg2?濃度 |
2–5 mM |
影響Taq酶活性，過高會增加非特異性擴增 |
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引物濃度 |
0.1–1 μM |
過高易形成引物二聚體，過低則擴增效率下降 |
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模板量 |
根據豐度調整 |
高豐度樣本宜稀釋，避免抑制效應 |
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熒光檢測模式 |
SYBR Green 或 TaqMan探針 |
前者成本低但可能有非特異信號；后者特異性高，適合多重檢測 |
補充說明：SYBR Green法適用于初步篩查，而探針法更適合精確定量與多重反應。
5、運行與數據分析規范
設置基線與閾值，確保Ct值準確可靠；
使用標準曲線進行絕對定量，或采用2?ΔΔCt法進行相對定量；
遵循MIQE指南（qPCR實驗質量規范），提升數據可重復性。
下一步
為確保熒光定量PCR（qPCR）實驗成功，請務必：
在正式實驗前進行預實驗，優化退火溫度與引物濃度；
每次實驗包含陰性對照（NTC）、陽性對照與內參基因；
記錄完整實驗條件，便于后續復現實驗結果。
