PCR（聚合酶鏈式反應）是基因檢測、病原體鑒定和臨床診斷中的核心技術，但假陽性、假陰性和結果不可重復等問題常影響其可靠性。影響準確性的因素包括引物設計不當、模板污染、抑制劑存在、儀器差異及操作不規范等。因此，需通過標準化流程和技術優化來確保結果可信。
核心優化策略
1.引物與探針設計
使用專業軟件進行特異性引物設計，避免形成二聚體或發夾結構，長度控制在18–25 bp，GC含量40%–60% 。
可采用鎖核酸探針（LNA） 提高對錯配序列的識別能力，尤其適用于低頻突變檢測。
探針應高度匹配目標序列，如TaqMan探針可增強特異性和靈敏度。
2.樣本處理與核酸提取
確保DNA/RNA模板的純度與完整性：A260/A280比值應在1.8–2.0之間，避免血紅素或多糖類物質抑制Taq酶活性。
通過高效提取方法（如磁珠法或硅膠柱法）減少洗脫體積，提升回收率30%以上
對復雜樣本（如腦脊液、血漿）可采取濃縮措施（乙醇沉淀、真空濃縮）以提高模板濃度。
清除抑制劑：添加BSA（1–2 μg/μL）或使用二次純化柱去除蛋白或多糖干擾。
3.反應體系與條件優化
|
優化項 |
推薦參數/做法 |
目標效果 |
|
引物濃度 |
50–900 nM |
避免非特異擴增 |
|
探針濃度 |
~200 nM |
提高信號強度與特異性 |
|
Mg2?濃度 |
根據緩沖液調整 |
影響酶活性與退火特異性 |
|
退火溫度 |
基于Tm值優化 |
提升擴增效率與特異性 |
|
循環次數 |
通常35–45輪 |
防止平臺期偏差 |
|
模板量 |
10?–10?起始分子 |
平衡靈敏度與背景噪音 |
（補充說明）反應成分需平衡，過高模板可能導致非特異擴增，過低則難以檢出目標
4.質量控制與對照設置
必須設置陰陽性對照：
陽性對照：驗證PCR體系是否正常工作；
陰性對照（無模板對照NTC）：監測是否存在污染或試劑異常。
每批實驗加入弱陽性質控品、空白對照和內參基因，便于數據校正與溯源。
使用經過驗證的標準品（如10 CFU/ml支原體標準品）評估試劑盒性能。
5.防止交叉污染
實驗區域物理分隔：樣本制備、擴增和產物分析應在不同區域進行。
使用專用移液器和耗材，定期用核酸清除劑（如PCRClean?） 處理臺面與設備，有效降解短片段核酸污染。
避免“蜻蜓點水”式采樣，防止人為引入誤差。
6.數據分析與結果判讀
合理設置熒光閾值，確保CT值落在指數擴增期內，獲得可靠定量結果。
利用算法模型輔助判斷：例如成都徠伯益公司開發的CT值預測系統，能識別異常熒光曲線并提示潛在問題，提升判讀準確性。
采用ΔΔCT法進行相對定量分析，并結合標準曲線實現絕對定量。
7.設備與試劑管理
定期校準PCR儀溫控模塊和光學系統，保證擴增一致性。
選用經國家藥監局批準、符合《歐洲藥典》等標準的試劑盒，確保檢測限達標（如≤10 CFU/ml）。
不同品牌試劑間可能存在100倍以上的檢測差異，應固定使用同一廠家產品以保持可比性。
建議
為全面提升PCR檢測準確性，建議采取以下綜合措施：
所有操作人員持證上崗并接受定期培訓；
建立完整的原始記錄制度，包含儀器編號、試劑批次、復檢原因等信息，便于追溯
實施信息化管理系統，整合“采、送、檢、報”流程，減少人工誤差；
對關鍵項目（如支原體檢測）使用配套標準品和內控對照，確保符合法規要求。
