ELISA實驗依賴于酶催化底物產(chǎn)生可檢測信號，從而實現(xiàn)目標(biāo)分子的定性或定量分析。常用的酶包括辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP），它們各自匹配不同的底物系統(tǒng)。選擇合適的底物直接影響實驗的靈敏度、穩(wěn)定性、背景水平和操作便利性。
ELISA常用底物類型與特性對比
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底物名稱 |
對應(yīng)酶 |
顯色/信號特征 |
最大吸收波長(nm) |
靈敏度 |
穩(wěn)定性 |
注意事項 |
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TMB |
HRP |
藍(lán)色 → 加酸終止后變黃色 |
652 → 450 |
高 |
中等 |
易產(chǎn)生背景，需控制顯色時間；推薦用于高靈敏度檢測 |
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OPD |
HRP |
橙黃色 |
492 |
中 |
較差 |
光照易褪色，有毒性，需避光操作 |
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ABTS |
HRP |
綠色 |
650 |
中低 |
好 |
顯色緩慢，適合低背景要求實驗 |
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pNPP |
AP |
黃色 |
405 |
中 |
好 |
化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，適用于長時間讀板 |
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4MUG |
β-D-Gal |
熒光 |
- |
高 |
- |
需熒光讀板儀，不常見 |
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CSPD/CDP-Star |
AP |
化學(xué)發(fā)光 |
- |
極高 |
信號衰減快 |
需化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，適合痕量檢測 |
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Luminol-based (ECL) |
HRP |
化學(xué)發(fā)光 |
- |
極高 |
信號衰減較快 |
成本較高，需專用設(shè)備 |
補充說明：從實際應(yīng)用來看，TMB是目前最主流的比色底物，因其靈敏度高且相對安全；而化學(xué)發(fā)光底物雖靈敏度更高，但需要特殊儀器支持。
底物選擇的關(guān)鍵考量因素
1、檢測設(shè)備匹配：
若實驗室僅有普通酶標(biāo)儀，應(yīng)選擇比色底物（如TMB、pNPP）；若有化學(xué)發(fā)光檢測能力，可優(yōu)先考慮化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)以提高靈敏度。
2、實驗靈敏度要求：
高靈敏度需求 → 推薦TMB 或化學(xué)發(fā)光底物
常規(guī)檢測 → 可選 pNPP或OPD
3、安全性與操作便利性：
OPD具有潛在致癌風(fēng)險且需現(xiàn)配現(xiàn)用，現(xiàn)已逐漸被更安全的TMB取代。TMB單組分溶液可直接使用，操作簡便。
4、信號穩(wěn)定性：
比色反應(yīng)信號相對穩(wěn)定，適合批量讀板；化學(xué)發(fā)光信號可能隨時間衰減，建議在顯色后盡快讀數(shù)。
5、實驗類型適配：
夾心法、競爭法等均適用上述底物，但需確保底物與所用酶標(biāo)抗體匹配（HRP對應(yīng)TMB/OPD，AP對應(yīng)pNPP）。
建議
常規(guī)ELISA實驗首選TMB：綜合性能最優(yōu)，適合大多數(shù)科研場景。
微量目標(biāo)物檢測選化學(xué)發(fā)光底物：當(dāng)待測物濃度極低時，可提升檢出率。
注意底物保存條件：TMB需避光保存，防止提前顯色；化學(xué)發(fā)光底物應(yīng)在-20℃避光儲存。
避免交叉污染：不同批次底物建議做預(yù)實驗驗證活性，不可混用不同廠家組分。
